盘龙七片调节骨保护素/核因子kB受体活化因子配体信号通路对去卵巢骨质疏松大鼠的影响
盘龙七片可能通过抑制RANKL水平，上调OPG表达，改善去卵巢大鼠的骨质疏松症状。
骨质疏松症(Osteoporosis，OP)是一种全身性骨代谢疾病，其主要特征是骨量减少、骨组织细微结构退化、骨强度降低，其潜在机制是骨骼吸收与骨骼成骨之间的不平衡，表现为骨脆性及骨折危险性增加。
研究表明绝经后骨质疏松症(PMOP)是骨质疏松症最常见的一种，绝经后老年女性的骨质疏松发病率高达49％，常因轻度暴力或非创伤因素而导致脆性骨折。
骨保护素(OPG)、核因子-kB受体活化因子配体(RANKL)是重要的信号转导蛋白，OPG/RANKL信号通路在骨代谢的骨吸收过程中起着至关重要的作用，能影响破骨细胞在骨重构中生成、分化、成熟和功能的激活。
盘龙七片是一种中成药，临床上对不同的骨科疾病具有明显的临床疗效，调节骨代谢，改善骨科疾病。中医学认为骨质疏松症的发病与“血瘀”有关，并将其归于“骨痹”“骨痿”等范畴。盘龙七片有活血化瘀、通经活络、强筋壮骨的作用，恰好切中“骨痹”之要害。已有研究发现，盘龙七片在对骨质疏松性椎体压缩骨折患者术后恢复的治疗过程中具有显著作用。
因此，本研究通过建立去卵巢大鼠模型探究盘龙七片对去卵巢骨质疏松大鼠的药效作用以及对股骨组织中 OPG/RANKL信号通路的影响。
1.材料与方法
1.1.动物
实验所用大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司提供,75只雌性 SD(Sprague Dawley)大鼠,4个月龄,SPF级,体质量(338.26±20.48)g,所有大鼠均在动物房中饲养,保持动物房环境及鼠笼清洁、通风,12h的光/暗周期,温度(24±2)℃,相对湿度为58％±2％,自由获取饲料和饮水。
1.2.主要试剂及仪器
盘龙七片(国药准字Z61020050,陕西盘龙药业集团股份有限公司)等。
双能X线骨密度分析仪(美国NORLAND公司)；光学显微镜(Nikon Eclipse80i,日本)；MX-0580-骨科生物力学测试仪(中国上海衡翼精密仪器有限公司)等。
1.3.方法
1.3.2.给药处理 造模完成24h后,假手术、模型组皮下注射10mL/kg0.9％生理盐水,阳性药组(1mg/kg)每天皮下注射10mL/kg 17β-雌二醇(0.1mg/mL)；盘龙七片换算设置低(0.26g/kg)、高剂量组(1.29g/kg)，并用生理盐水配置为0.026,0.129g/mL混悬液以10mL/kg的剂量灌胃给药，1次/d，持续给药8周。
1.3.3.大鼠存活情况 实验进行过程中,各组大鼠存在不同数量的死亡,最后,假手术组纳入实验15只,模型组13只,阳性药物组14只,低剂量组14只,高剂量组15只。
1.3.4.样本采集 骨密度测完后,用酒精和碘伏消毒手术部位,开腹,腹主动脉采血,1500r/min离心15min,取上层血清,取出大鼠左后肢股骨,灭菌后-70℃保存。
1.3.5.骨密度测定 各组大鼠左后肢离体股骨平置于双能X线骨密度平台上测定左股骨部位骨矿含量。
1.3.6.骨生物力学检测 左侧股骨放在生物力学万能实验机上,压头以2mm/min速度下降,直至股骨断裂。采集数据并绘制载荷-变形曲线,测得******挠度、弹性载荷、弹性挠度,计算出******载荷和弹性模量。
1.3.7.HE染色 左侧股骨远端用含10％福尔马林的乙二胺四乙酸溶液(EDTA)脱钙4周后石蜡包埋。将石蜡包埋的股骨组织切成4μm切片的标本进行HE染色。用光学显微镜对染色的股骨进行观察和成像。
1.3.8.血清中骨代谢标志物β-CTX、BALP浓度 检测各组动物血清中血清β-胶原降解产物(β-CTX)、骨碱性磷酸酶(BALP)含量等指标,具体操作按试剂盒说明书进行。
2.结果
2.1.盘龙七片对去卵巢大鼠骨密度的影响
各且大鼠左后肢离体股骨骨密度比较见表1，与假手术组相比，模型组大鼠BMC显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；与模型组相比，阳性药物组、低剂量组、高剂量组BMC含量明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与阳性药物组相比，低剂量组BMC较低，差异有统计学意义(P＜0.05)，高剂量组BMC较高，差异有统计学意义(P＜0.05)。
2.2.盘龙七片对去卵巢大鼠骨生物力学特性的影响
各组大鼠左后肢离体股骨生物力学特性比较见表2，与假手术组相比，模型组******载荷与弹性模量均显著下降，差异有统计学意义(P＜0.05）；与模型组相比，阳性药物组、低剂量组、高剂量组******载荷与弹性模量明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与阳性药物组相比，低剂量组******载荷与弹性模量较低，差异有统计学意义（P＜0.05），高剂量组******载荷与弹性模量较高，差异有统计学意义(P＜0.05)。
2.3.盘龙七片对去卵巢大鼠骨组织形态的影响
HE染色检测大鼠左股骨病理损伤见图1。与假手术组相比，模型组左侧股骨远端骨小梁稀疏、结构不完整、明显变薄、排列紊乱，存在大量空骨陷窝，骨小梁连通性丧失，骨小梁间隙增宽；与模型组相比，低剂量组左侧股骨远端骨小梁有所改善，阳性药物组与高剂量组左侧股骨远端骨小梁形态结构明显改善，骨小梁结构完整，空骨陷窝减少，骨小梁排列更加整齐，高质量组恢复************。
3.讨论
绝经后骨质疏松症病理机制复杂，尚无有效、安全的治疗方法。西药主要采用骨吸收抑制剂(雌激素)、骨形成和骨矿化促进剂等治疗手段。但这些药物长期服用会引发一系列不良反应，如血栓形成、冠心病及乳腺癌等。中医药的方法治疗骨科疾病是医药领域研究的热点内容。
3.讨论
绝经后骨质疏松症病理机制复杂，尚无有效、安全的治疗方法。西药主要采用骨吸收抑制剂(雌激素)、骨形成和骨矿化促进剂等治疗手段。但这些药物长期服用会引发一系列不良反应，如血栓形成、冠心病及乳腺癌等。中医药的方法治疗骨科疾病是医药领域研究的热点内容。
本研究建立去卵巢动物模型，首先探讨盘龙七片对骨质疏松大鼠骨密度的影响，结果显示模型组大鼠BMC、******载荷与弹性模量显著降低，HE染色结果显示，模型组左侧股骨远端骨小梁稀疏、结构不完整、明显变薄、排列紊乱，说明去卵巢后骨组织明显受损严重，与李永贤等构建去卵巢大鼠模型后骨组织组织结构染色结果相一致，表明骨质疏松大鼠模型建立成功。给予盘龙七片治疗后，大鼠BMC含量、******载荷与弹性模量明显升高，低剂量组左侧股骨远端骨小梁有所改善，阳性药组与高剂量组左侧股骨远端骨小梁形态结构均明显改善，且高质量组恢复************，说明盘龙七片能显著提高骨密度，提示盘龙七片有利于缓解大鼠的骨质疏松状况。
PMOP是由于体内卵巢功能降低，引起骨偶联过程RANKL和OPG蛋白分泌失衡，骨吸收超过骨形成，从而导致净骨量减少，骨脆性增加，骨强度降低。研究表明多数中西药对去卵巢后骨质疏松大鼠的治疗机理都与OPG/RANKL通路有关。吴彬等研究发现雌马酚能有效改善去卵巢后大鼠骨质疏松症，可能与其能上调OPG而抑制RANKL分泌有关。颜春鲁等发现地黄饮子可能通过调控 OPG/RANKL/RANK 信号通路发挥抗去卵巢大鼠骨质疏松的作用。
本研究中，去卵巢后模型组大鼠骨组织OPG蛋白表达水平较假手术组显著下降，RANKL蛋白水平显著上调，RANKL与OPG之间失衡，从而导致大鼠骨形成与骨吸收失衡，发生骨质疏松。给予盘龙七片治疗后，阳性药物组、低剂量组、高剂量组大鼠骨组织较模型组OPG蛋白表达水平显著上升，RANKL蛋白水平显著下降且高剂量组大鼠骨组织OPG蛋白表达水平最高，RANKL蛋白表达水平最低，说明盘龙七片能够上调骨保护相关蛋白合成，促进骨形成作用，且效果优于阳性药物，提示盘龙七片可能通过调控OPG/RANKL通路改善去卵巢大鼠的骨质疏松。
综上所述
RANKL/OPG信号通路激活与PMOP病理过程有密切关系，盘龙七片可能通过抑制RANKL表达，促进OPG表达，促进骨形成，抑制骨吸收，进而减轻骨质疏松程度，可能为临床上利用盘龙七片对PMOP治疗提供了理论参考，但盘龙七片调控OPG/RANKL信号通路的具体机制仍需进一步探究。
陕公网安备61011102000338号
